· poliakrilamidgel mora biti akrilamidni monomer, polimerizacijski početni materijal, katalizator i desna smjesa soli i pufera zajedno.
· akrilamidi BIS (N,N'- metilen dvostruki akrilamid) je matrica gela u obliku monomera.
· amonijev persulfat započinje proces polimerizacije ljepila.Formulacija ljepila zahtijeva 10% otopinu amonijevog persulfata pripremljenu u vodi.Većina informacija ukazivala je na potrebu za aktivnim korištenjem.Međutim, 10% otopina može se staviti na 4 ℃ nekoliko tjedana bez značajnog gubitka aktivnosti.Nadopuniti do 10 ml i baciti kad se ljepilo prestane sjedinjavati.
Savjet: postotak odakrilamidu sekvenciranju ljepilo i proteinsko ljepilo nije isto.Ako koristite prethodno pripremljenu otopinu akrilamida: BIS, pobrinite se da nabavite odgovarajuću bocu.
· TEMED (N,N,N',N'- tetrametil etilendiamin) je katalizator, u smeđoj bočici, čuva se u hladnjaku.Dodajte neposredno prije ulijevanja ljepila.
· poliakrilamidna elektroforeza staklo koje se koristi u elektroforezi treba oprati prije i poslije svakog puta.Nakon elektroforeze operite mekom četkom i krpom u vrućoj sapunici, isperite destiliranom vodom i ostavite da se osuši.
· vlaga i prašina mogu uzrokovati šuplji polimer.Prije elektroforeze očistite staklenu ploču sredstvom za čišćenje stakla i obrišite je mekom četkom.Operite destiliranom vodom i temeljito osušite papirnom maramicom.Ispiranje sa 70% etanolom prije brisanja papirom pomaže u čišćenju i ubrzava sušenje.Dodajte uzorke akrilamida redom: BIS, vodu, pufersku otopinu, amonijev persulfat, TEMED.Dobro protresite i odmah ulijte.
Nije potrebno degazirati poliakrilamid prije polimerizacije.(Akrilamid se stavljao u vakuum kako bi se uklonili mjehurići jer kisik inhibira polimerizaciju.)
Horizontalne vrhove za uzorke ljepila.
· stavite komad crnog papira u donju kutiju, crnu pozadinu kako biste napravili rupu za uzorak kako biste jasnije vidjeli.
· spremnik ljepila ispunjen puferom, neposredno iznad koloida.
· ako rub ima svjetlo, upalite svjetla, neka svjetlo svijetli koloidno.Uvucite uzorak u pipetu.
· pomoću uređaja za automatsko pipetiranje.
· u 10-200 mu 1 pokretna točka tekućine može se koristiti u većini točaka na uzorku.Za vrlo male rupe za uzorke (manje od 10μ1), dugačka glava pipete koja se koristi za sekvenciranje ljepila je prikladnija.
· pipetiranje upravo uronjenog u uzorak, udisanje tekućine koja se sporo kreće.Uzorak može izgledati ljepljiv od glicerina, a brzo pumpanje može uvući mjehuriće zraka u glavu pipete.
· uzorci nakon udisanja glave za pipetiranje, lagano će pomicati glavu tekućine po rubu cijevi ili papir za brisanje usisati glavu tekućine izvan kapljica.Pazite da ne usisate uzorak.
Stavite uzorak u otvor za uzorak
· uređaj za pipetiranje za održavanje malog pritiska, neka se uzorci lagano pomaknu preko glave tekućine.
· glava za pipetiranje umetnuta u međuspremnik, malo više od točkastih otvora, održava pozitivan tlak.Vrh pipete može se umetnuti u malu rupu.
· polako i ravnomjerno izlaze uzorci.Vrh pipete se postavlja iznad točkaste rupe za uzorkovanje i uzorak će potonuti u rupu.Pustite uzorak da potone kako bi ispunio otvor za uzorak umjesto da ga gurate unutra.
· kada padne posljednja kap uzorka s tekućim vrhom, tekućina će prijeći na drugu nogu, polako podići tekućinu, pomaknuti se iz pufera
Kako napraviti okomito uzorkovanje ljepila?
· okomite rupe za uzorke točke lijepljenja formirane između dva komada stakla.U vrlo tankom ljepilu, glava pipete ne može se čak ni umetnuti između dvije staklene ploče.Pazi na glicerin!Stavite glavu pipete preko otvora za uzorak i uzorak će utonuti u otvor.
· točkasti uzorak prije, svakako stavite okomitu točku polipropilen acilnog gela za uzorak, rupa se ispere.Isperite nepolimerizirani akrilamid i vodu koja se može pojaviti na dnu rupe za uzorkovanje.Voda može znatno smanjiti rupu za uzorkovanje.Upotrijebite štrcaljku od 25 ml ili 50 ml i iglu kalibra 18.Ulijte pufer za elektroforezu i pažljivo isperite otvor za uzorak.
· može biti teško vidjeti rupu za uzorak, ali u isto vrijeme, ostalo je jednostavno.Ako ima viška rupa, pufer uzorka može se testirati bromfenol plavim.
Vrijeme objave: 31. ožujka 2023