· poliakrilamidGel se mora sastojati od akrilamidnog monomera, početnog materijala za polimerizaciju, katalizatora i smjese soli i pufera.
· akrilamida BIS (N, N'-metilen dvostruki akrilamid) je monomer u obliku gel matrice.
· amonijev persulfat započinje proces polimerizacije ljepila. Formulacija ljepila zahtijeva 10%-tnu otopinu amonijevog persulfata pripremljenu u vodi. Većina informacija ukazuje na potrebu za aktivnom upotrebom. Međutim, 10%-tna otopina može se držati na 4 ℃ nekoliko tjedana bez značajnog gubitka aktivnosti. Dopuniti do 10 ml i baciti kada se ljepilo ne agregira.
Savjet: PostotakakrilamidU sekvenciranju ljepilo i proteinsko ljepilo nije isto. Ako koristite gotovu otopinu akrilamida:BIS, provjerite imate li pravu bocu.
· TEMED (N, N, N', N'- tetrametil etilendiamin) je katalizator, u smeđoj boci, smještenoj u hladnjak. Dodaje se neposredno prije izlijevanja ljepila.
· poliakrilamidna elektroforeza: staklo korišteno u elektroforezi treba oprati prije i poslije svakog korištenja. Nakon elektroforeze, operite mekom četkom i krpom u vrućoj vodi sa sapunom, isperite destiliranom vodom i ostavite da se osuši.
· vlaga i prašina mogu uzrokovati šuplji polimer. Prije elektroforeze očistite staklenu ploču sredstvom za čišćenje stakla i obrišite je mekom četkom. Operite destiliranom vodom i temeljito osušite papirnatim maramicama. Ispiranje 70%-tnim etanolom prije brisanja papirom pomaže u čišćenju i ubrzavanju sušenja. Redom dodajte uzorke akrilamida: BIS, vodu, pufersku otopinu, amonijev persulfat, TEMED. Dobro protresite i odmah ulijte.
Nije potrebno degazirati poliakrilamid prije polimerizacije. (Akrilamid se prije stavljao u vakuum kako bi se uklonili mjehurići jer kisik inhibira polimerizaciju.)
Uzorci vrhova za horizontalne ljepljive točke.
· Stavite komad crnog papira u donju kutiju, crna pozadina kako biste napravili rupu za uzorak i jasnije vidjeli.
· pufer napunjen spremnikom ljepila, odmah preko koloida.
· ako rub ima svjetlo, upalite svjetla, pustite da svjetlo obasja koloid. Uvucite uzorak u pipetu.
· korištenjem automatskog uređaja za pipetiranje.
· u 10-200 mu 1 točka za pomicanje tekućine može se koristiti u većini točaka na uzorku. Za vrlo male rupe u uzorku (manje od 10μ1), dugačka glava pipete koja se koristi za sekvenciranje ljepila je praktičnija.
· pipetiranje samo uronjeno u uzorak, udisanje tekućine koja se polako kreće. Uzorak može izgledati ljepljivo od glicerina, a brzo pumpanje može privući mjehuriće zraka u glavu pipete.
· Uzorci nakon udisanja pipete, lagano pomiču glavu tekućine po rubu cijevi ili papirom za brisanje usišu glavu tekućine izvan kapljica. Pazite da ne usišete uzorak.
Stavite uzorak u otvor za uzorak
· uređaj za pipetiranje za održavanje malog pritiska, lagano pomičite glavu preljevne tekućine uzoraka.
· glava pipete umetnuta u pufer, malo više od točkastih rupica, održava pozitivan tlak. Vrh pipete može se umetnuti u malu rupicu.
· polako i postojano vadite uzorke. Vrh pipete postavlja se iznad otvora za uzorak i uzorak će utonuti u otvor. Pustite da uzorak utone kako bi se ispunio otvor za uzorak umjesto da ga gurate unutra.
· Nakon što posljednja kap uzorka padne na tekuću glavu, tekućina će se pomaknuti na drugu nogu, polako podići kretanje tekućine i izaći iz pufera
Kako napraviti vertikalno uzorkovanje ljepila?
· vertikalne točke lijepljenja rupe za uzorke formirane između dva komada stakla. Kod vrlo rijetkog ljepila, glava pipete se ne može ni umetnuti između dvije staklene ploče. Pazite na glicerin! Stavite glavu pipete preko rupe za uzorak i uzorak će utonuti u rupu.
· Prije uzimanja uzorka, obavezno isperite otvor za uzorak s okomitom točkom od polipropilenskog acil gela. Isperite nepolimerizirani akrilamid i vodu koja se može pojaviti na dnu otvora za uzorak. Voda može znatno smanjiti otvor za uzorak. Koristite špricu od 25 ml ili 50 ml i iglu kalibra 18. Ulijte pufer za elektroforezu i pažljivo isperite otvor za uzorak.
· Može biti teško vidjeti otvor za uzorak, ali istovremeno je ostalo lako. Ako postoji višak otvora, pufer za uzorak može se testirati bromofenol plavilom.
Vrijeme objave: 31. ožujka 2023.