· poliakrilamidgel mora biti akrilamidni monomer, polimerizacijski početni materijal, katalizator i desna smjesa soli i pufera zajedno.
· akrilamidi BIS (N,N'- metilen dvostruki akrilamid) je matrica gela u obliku monomera.
· amonijev persulfat započinje proces polimerizacije ljepila. Formulacija ljepila zahtijeva 10% otopinu amonijevog persulfata pripremljenu u vodi. Većina informacija ukazivala je na potrebu za aktivnim korištenjem. Međutim, 10% otopina može se staviti na 4 ℃ nekoliko tjedana bez značajnog gubitka aktivnosti. Nadopuniti do 10 ml i baciti kad se ljepilo prestane sjedinjavati.
Savjet: postotak odakrilamidu sekvenciranju ljepilo i proteinsko ljepilo nije isto. Ako koristite prethodno pripremljenu otopinu akrilamida: BIS, pobrinite se da nabavite odgovarajuću bocu.
· TEMED (N,N,N',N'- tetrametil etilendiamin) je katalizator, u smeđoj bočici, čuva se u hladnjaku. Dodajte neposredno prije ulijevanja ljepila.
· poliakrilamidna elektroforeza staklo koje se koristi u elektroforezi treba oprati prije i poslije svakog puta. Nakon elektroforeze operite mekom četkom i krpom u vrućoj sapunici, isperite destiliranom vodom i ostavite da se osuši.
· vlaga i prašina mogu uzrokovati šuplji polimer. Prije elektroforeze očistite staklenu ploču sredstvom za čišćenje stakla i obrišite je mekom četkom. Operite destiliranom vodom i temeljito osušite papirnom maramicom. Ispiranje sa 70% etanolom prije brisanja papirom pomaže u čišćenju i ubrzava sušenje. Dodajte uzorke akrilamida redom: BIS, vodu, pufersku otopinu, amonijev persulfat, TEMED. Dobro protresite i odmah ulijte.
Nije potrebno degazirati poliakrilamid prije polimerizacije. (Akrilamid se stavljao u vakuum kako bi se uklonili mjehurići jer kisik inhibira polimerizaciju.)
Horizontalne vrhove za uzorke ljepila.
· stavite komad crnog papira u donju kutiju, crnu pozadinu kako biste napravili rupu za uzorak kako biste jasnije vidjeli.
· spremnik ljepila ispunjen puferom, neposredno iznad koloida.
· ako rub ima svjetlo, upalite svjetla, neka svjetlo svijetli koloidno. Uvucite uzorak u pipetu.
· pomoću uređaja za automatsko pipetiranje.
· u 10-200 mu 1 pokretna točka tekućine može se koristiti u većini točaka na uzorku. Za vrlo male rupe za uzorke (manje od 10μ1), dugačka glava pipete koja se koristi za sekvenciranje ljepila je prikladnija.
· pipetiranje upravo uronjenog u uzorak, udisanje tekućine koja se sporo kreće. Uzorak može izgledati ljepljiv od glicerina, a brzo pumpanje može uvući mjehuriće zraka u glavu pipete.
· uzorci nakon udisanja glave za pipetiranje, lagano će pomicati glavu tekućine po rubu cijevi ili papir za brisanje usisati glavu tekućine izvan kapljica. Pazite da ne usisate uzorak.
Stavite uzorak u otvor za uzorak
· uređaj za pipetiranje za održavanje malog pritiska, neka se uzorci lagano pomaknu preko glave tekućine.
· glava za pipetiranje umetnuta u međuspremnik, malo više od točkastih otvora, održava pozitivan tlak. Vrh pipete može se umetnuti u malu rupu.
· polako i ravnomjerno izlaze uzorci. Vrh pipete se postavlja iznad točkaste rupe za uzorkovanje i uzorak će potonuti u rupu. Pustite uzorak da potone kako bi ispunio otvor za uzorak umjesto da ga gurate unutra.
· kada padne posljednja kap uzorka s tekućim vrhom, tekućina će prijeći na drugu nogu, polako podići tekućinu, pomaknuti se iz pufera
Kako napraviti okomito uzorkovanje ljepila?
· okomite rupe za uzorke točke lijepljenja formirane između dva komada stakla. U vrlo tankom ljepilu, glava pipete ne može se čak ni umetnuti između dvije staklene ploče. Pazi na glicerin! Stavite glavu pipete preko otvora za uzorak i uzorak će utonuti u otvor.
· točkasti uzorak prije, svakako stavite okomitu točku polipropilen acilnog gela za uzorak, rupa se ispere. Isperite nepolimerizirani akrilamid i vodu koja se može pojaviti na dnu rupe za uzorkovanje. Voda može znatno smanjiti rupu za uzorkovanje. Upotrijebite štrcaljku od 25 ml ili 50 ml i iglu kalibra 18. Ulijte pufer za elektroforezu i pažljivo isperite otvor za uzorak.
· može biti teško vidjeti rupu za uzorak, ali u isto vrijeme, ostalo je jednostavno. Ako ima viška rupa, pufer uzorka može se testirati bromfenol plavim.
Vrijeme objave: 31. ožujka 2023